Unità 2 - Milano
L'attività svolta dall'Unità di Milano (Moroni-Costa) può essere riassunta nei seguenti punti:
- realizzazione di un canale Kcv insensibile ai ROS: da una prima indagine effettuata sul canale ionico Kcv, è emerso che la sua attività è modulata da ROS, reactive oxygen species. L’applicazione di acqua ossigenata (H2O2) infatti, diminuisce la corrente del canale espresso in oociti di Xenopus. Dato che intendiamo indirizzare Kcv al mitocondrio, in un ambiente cioè ricco di ROS, abbiamo dovuto per prima cosa eliminare questa proprietà. Dall’analisi della sequenza sono stati individuati 5 amminoacidi, 2 cisteine e tre metionine, che sono stati mutati sia individualmente che insieme. La singola mutazione della metionina 15 in alanina (M15A) ha completamente rimosso la sensibilità a H2O2. Met15 si trova all’inizio del primo segmento transmembrana in una zona importante per il gating. Pensiamo che interagisca con la porzione C-terminale dell’elica 2 contribuendo a stabilizzare lo stato di chiusura del canale.
- selezione delle sonde FRET (cameleon-based) per l’analisi mitocondriale dei livelli di Ca2+, ATP e red-ox.
Per l’analisi delle dinamiche del Ca2+ mitocondriale sono state selezionate le sonde FRET Cameleon 4mt-D3cpv (Palmer et al., 2006 Chem Biol), 4 mtD1cpv (Giacomello et al., 2010 Mol Cell) ed è stata generata una nuova sonda usando una terza variante dei Cameleon 4mt-YC3.6. Tutte le sonde sono clonate nel vettore di espressione pCDNA3.
Per l’analisi dei livelli di ATP mitocondriale è stata selezionata la sonda FRET 2mt-ATeam1.03 (Imamura et al., 2009 PNAS).
Per l’analisi dello stato redox mitocondriale si é scelto di utilizzare la sonda GRX-roGFP2 (Albrecht et al., 2011 Cell Metabolism) che a differenza delle sonde per l’analisi delle dinamiche del Ca2+ o dei livelli di ATP non è una sonda basata sulla FRET, bensì sulla formazione di ponti disolfulro, mediati dall’ossidazione del pool di glutatione, in una GFP redox sensibile.