Unità 3 - CNR - ISTITUTO DI BIOFISICA

CANALI IONICI VACUOLARI

Oligomerizzazione

ATKCO3 possiede due segmenti transmembrana (2TM) che delimitano un loop (1P) che dovrebbe partecipare alla formazione del poro di permeazione. Durante la valutazione del progetto PRIN abbiamo stabilito che AtKCO3, forma dimeri che sono localizzati nel tonoplasto. Poiché 4 loop (4P) sono necessari a formare il poro di permeazione, l’oligomero non può essere attivo. In accordo con i dati di oligomerizzazione, non abbiamo riscontrato alterazioni di corrente in vacuoli isolati da piante transgeniche sovraesprimenti KCO3 o KCO3::GFP e non abbiamo osservato marcati cambiamenti fenotipici in piante knock-out, a parte una crescita ridotta a seguito di stress osmotico. Questi risultati sono pubblicati in Rocchetti et al, 2012, Front. Plant Sci. 3, Article 251.

Stiamo producendo piante transgeniche esprimenti TPC1::GFP.

Traffico e smistamento intracellulare

Le piante transgeniche esprimenti AtTPC1::GFP saranno utilizzate per questi studi oltre che per quelli sul rapporto fra oligomerizzazione e traffico.

Abbiamo pubblicato una review che fa il punto sui meccanismi e segnali molecolari per il traffico al tonoplasto ed è la prima review specificatamente dedicata a quest’argomento (Pedrazzini et al, 2013, vedi elenco).

Abbiamo fuso segmenti transmembrana di diversa lunghezza a un reporter (p24 di HIV) in modo da produrre una proteina integrale di membrana di tipo 1 (1TMD, estremità N-terminale luminare). In piante transgeniche questi costrutti localizzano in diversi comparti della via di secrezione (reticolo endoplasmatico, trans-Golgi network o membrana plasmatica, rispettivamente con TMD di 17, 20 o 23 aminoacidi) ma non al tonoplasto. Questi risultati sostengono il modello secondo il quale lo smistamento al tonoplasto, ma non quello alla membrana plasmatica, richiede segnali specifici. Questi dati sono ora pubblicati in Goretti et al, Int. J. Mol. Sci., 14, 13241-13265.

Turnover

Abbiamo espresso transientemente in protoplasti KCO3 e KCO3::GFP e abbiamo effettuato esperimenti di pulse-chase con aminoacidi radioattivi. Anche KCO3::GFP rilascia GFP post-traduzionalmente, come da noi già osservato nel caso di TPK1::GFP (Maîtrejean et al, 2011, Plant Physiol. 156,1783-1796).

Stiamo effettuando mutagenesi su TPK1::GFP al fine di inattivare i siti potenziali di ubiquitinazione. 

Studi funzionali

Con un precedente screening di “yeast two hybrid”, utilizzando come esca la regione C-terminale di KCO3, avevamo individuato due ABC transporter di classe A (ABCA2 e ABCA11) come possibili interattori di KCO3. Per stabilire il ruolo funzionale di questa interazione, stiamo analizzando piante di Arabidopsis knock out per ABCA2 o ABCA11

ILVACUOLO VEGETALE COME LISOSOMA MODELLO

Screening sistematico delle condizioni che possono portare TPC1 e TPC2 umani in vacuoli di Arabidopsis

Abbiamo verificato che la purezza del DNA che utilizziamo è importante per l’efficienza di trasformazione. In questo modo siamo riusciti a localizzare TPC2 su vacuoli del mesofillo di Arabidopsis. Siamo così riusciti a misurare, mediante metodica di patch-clamp, le sue principali proprietà funzionali.

Sequenze di indirizzo di tonoplasto note permettano una localizzazione nel tonoplasto efficiente quando fuse con TPC1 e TPC2?

Abbiamo fuso all’N-terminale dei canali umani TPC1 e TPC2  i primi 124 aminoacidi dell’N-terminale di CLC-7 di ratto necessari per la localizzazione lisosomale di questo antiporto. Tuttavia non abbiamo ottenuto un miglioramento nell’efficienza di localizzazione.

AtTPC1 vegetale sarà modificato rimpiazzando specifici domini con sequenze omologhe di TPC1 o TPC2 umani

Abbiamo verificato che TPC2 umano è selettivo per lo ione sodio mentre TPC1 di Arabidopsis è un canale cationico in cui sodio e potassio permeano in modo simile. Vogliamo trovare la sequenza che è responsabile di questa differenza.