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PROTEINE DELLA MEMBRANA MITOCONDRIALE: STUDI MOLECOLARI
Il più antico argomento di ricerca del nostro laboratorio è la porina o VDAC (Voltage-dependent Anion selective Channel), una proteina transmembrana che permette al mitocondrio di essere in comunicazione con il citoplasma cellulare. Infatti forma un ampio canale idrofilico non selettivo nella membrana mitocondriale esterna, che è in grado di restringere il suo diametro in dipendenza del potenziale di membrana appplicato. Questa proteina è implicata nell’apoptosi, in quanto riesce a rendere permeabile la membrana mitocondriale esterna a fattori proteici interni quali il citocromo c. Inoltre è più in generale implicata nella regolazione del metabolismo bioenergetico perchè le sue caratteristiche elettrofisiologiche le permettono di modulare il traffico di ATP/ADP da/per i mitocondri.
Il nostro gruppo è conosciuto per la sua competenza su questa proteina, avendo contribuito con molte pubblicazioni sulla purificazione della proteina, il sequenziamento, il clonaggio, la caratterizzazione genetica e molecolare, la presenza di patologie da deficienza genetica, la determinazione della struttura sia con metodi chimico-fisici e molecolari sia con metodi computazionali. Attualmente siamo coinvolti in:
1) la determinazione della rilevanza funzionale di settori della struttura del canale
2) la differenziazione del ruolo intracellulare delle isoforme di VDAC
3) lo studio dell’espressione dei geni di VDAC nei mammiferi e in Drosophila melanogaster
4) l’interazione del VDAC con farmaci anti-tumorali
5) l'interazione del VDAC con la SOD1 e le sue forme mutate nell'ambito della SLA (Sclerosi Laterale Amiotrofica)
BARCODE OF LIFE
Uno dei più affascinanti progetti di ricerca post-genomici attualmente proposti nel mondo è il cosiddetto BARCODE OF LIFE, cioè l’attribuzione di un CODICE A BARRE molecolare a ciascuna specie vicente. Questo progetto ha vaste implicazioni sia di carattere filogenetico che di tipo applicativo-molecolare. Il nostro laboratorio partecipa a questa iniziativa studiando sequenze che, in specie di interesse commerciale, possano essere utilizzate per la definizione di barcoding di utilizzazione generale. L’aspetto bioinformatico di questa ricerca è molto rilevante.
STUDI CHIMICO-FISICI E MODELLING DI PROTEINE DI MEMBRANA
In collaborazione con gruppi locali ed internazionali, siamo interessati ad aspetti sperimentali e predittivi che contribuiscano alla delucidazione della struttura delle isoforme della porina.
In particolare abbiamo realizzato la sintesi di peptidi corrispondenti a sezioni della proteina e di essi abbiamo determinato la struttura e le caratteristiche chimico-fisiche tramite NMR, spettri CD, DSC accoppiati ad esperimenti di mutagenesi e di caratterizzazione molecolare in cellulo.
Tale esperimenti andranno avanti per altri peptidi.
Inoltre siamo coinvolti nella realizzazione di modelli strutturali bioinformatici per la caratterizzazione di proteine di membrana e di siti di docking.
PROTEOMICA
Il nostro laboratorio è attrezzato per l’analisi bi-dimensionale di miscele proteiche, prodromiche all’analisi proteomica propriamente detta. Inoltre collaboriamo strettamente con l'Unità di Proteomica dell'Università di Catania che è attrezzata con le più recenti strumentazioni, tra cui uno spettrometro Orbitrap.
I temi di cui ci interessiamo a livello proteomico sono i seguenti:
a) Interattomica in vivo mediante tecnologia TAP-tag (Tandem Affinity Purification con tag) di proteine di membrana.
Abbiamo costruito un plasmide per cellule eucariotiche in grado di esprimere una proteina bersaglio contenente una prima tag costituita da una sequenza di 6xHis fusa alla proteina fluorescente GFP, con la funzione di una seconda tag. Le due tag sono separate dal sito specifico di clivaggio della proteasi TEV (tobacco etch virus). La YFP fusa alla proteina di interesse è utile per poter seguire in microscopia fluorescente l’espressione della proteina-bersaglio nelle cellule eucariotiche. In seguito alla trasfezione, le cellule esprimono il costrutto con le due tag. La GFP permette di verificare che la localizzazione intracellulare della proteina sia corretta. Le tag permettono di effettuare l’immunoprecipitazione della chimera insieme al set di proteine interagenti. Il clivaggio con conseguente eliminazione della prima tag (GFP) aumenta la specificità e selettività del set finale di proteine che viene esaminato mediante 2D-elettroforesi e spettrometria di massa.
b) studio di miscele proteiche da prodotti alimentari.
Abbiamo contribuito sino ad ora allo studio e alla caratterizzazione proteomica del contenuto di cultivar di frumento locali siciliani. Siamo in generale interessati ad approfondire questo studio anche su altri prodotti alimentari per scopi di tracciabilità, anti-frode e caratterizzazione specie-specifica.